科研项目

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Scientific research projects
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蛙类脑膜炎败血伊丽莎白菌病

随着我国蛙类（牛蛙、黑斑蛙、金钱蛙、虎斑蛙、石蛙等）人工养殖的发展，出现一种以临床症状为食欲减退或丧失，歪头、身体失去平衡，在水中间歇性打转游动，腹部膨胀、四肢肿大、腿部肌肉出血，脚蹼卷曲、眼球角膜发白、类似人“白内障”，个别蛙皮肤溃疡；病理变化为腹腔内有一定量的清亮腹水，肝脏肿大淤血、呈花斑状，脾脏肿大、呈紫黑色，脑膜充血、歪头明显的蛙脑软化，个别病蛙肠道内有黏液、肠道壁变薄、呈半透明状的疾病。该病给我国蛙养殖业造成了巨大的经济损失。病原经鉴定为脑膜炎败血伊丽莎白菌。

所属分类:

研发项目

关键词: 畜牧技术、农林牧渔类

Tel:

023-46758666

产品介绍

 

青蛙脑膜炎败血伊丽莎白菌研究成果

【实验动物】

病蛙样本采自开州区某黑斑蛙养殖基地，体重、体况相近的健康黑斑蛙采购于重庆本地市场。

【实验试剂】

脑心浸液肉汤（BHI）购于北京华越洋生物科技有限公司，16SrDNA引物合成于华大基因，药敏试纸购于杭州微生物试剂有限公司，微量生化管购于杭州微生物试剂有限公司，多西环素购自重庆某公司，水溶性氟苯尼考购于江苏某公司，细菌基因组DNA提取试剂盒、DNA-marker DL-2000、Lysis Buffer为上海生工产品，其他涉及到的NaCl、酵母提取物、蛋白胨、琼脂糖均为国产分析纯试剂。

【实验仪器】

T100™ Thermal Cycler，美国BIO-RAD公司；凝胶成像系统JY04S-3C，北京君意东方电泳设备有限公司；制冰机IMS-20，常熟市雪科电器有限公司；生化培养箱LRH-250F，上海齐欣科学仪器有限公司；电泳仪JY200C，北京君意东方电泳设备有限公司；洁净工作台SW-CJ标准型，苏州安泰空气技术有限公司；LX-600微型离心机，其林贝尔仪器制造有限公司；海尔冰箱BCD-192KTJX，青岛海尔股份有限公司；立式压力蒸汽灭菌器YXQ-50A，上海博迅医疗生物仪器股份有限公司；电子分析天平EL104，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；Cascada BIO实验室超纯水系统，美国PALL公司。

【病原菌的分离】

在超净工作台内用酒精棉球对病蛙的体表进行初步消毒，准备好手术刀，剪刀等器械并提前用酒精灭菌，点燃酒精灯，在酒精灯旁切开病蛙的脑部，用镊子夹出病蛙脑组织，放入装有灭菌生理盐水的2ml规格的灭菌EP管内，并放于冰箱-20℃低温保存。

【病原菌的纯化】

提前用BHI配制好固体培养基和液体培养基（固体培养基中还需额外加入琼脂），取分离的脑组织在平板上进行多次划线并置于28℃恒温培养箱培养18-24小时，用接种环挑取单菌落接种于液体培养基中，放置在摇床上培养24小时后得到单菌落菌液。

【病原菌的生化鉴定】

将分离纯化后的单菌落（E3）菌液充分摇匀后，用接种环接种于葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、硫化氢、果糖等15个微量生化管中，放置于38℃恒温培养箱培养18-24小时后观察实验结果（表1）。可见E3菌株与脑膜炎败血伊丽莎白菌生理生化特性基本上一致,与相关资料中该菌种的特征相吻合，根据其生理生化特征的鉴定结果，可初步判断菌株E3为脑膜炎败血伊丽莎白菌。

表1生化鉴定结果

项目Items

菌株 Strain

E3

E.meningoseptica

革兰氏染色 Gram stain

-

-

细菌形态 Cellular morphology

短杆状 Short rod

短杆状 Short rod

运动性 Motility

-

-

葡萄糖 Glucose

-

-

麦芽糖 Maltose

-

-

甘露醇 Mannitol

-

-

木糖 Xylose

-

-

蔗糖 Sucrose

-

-

果糖 Fructose

-

-

乳糖 Lactose

-

-

硝酸盐还原 Nitrate reduction

-

-

硫化氢 Hydrogen sulfide

-

-

明胶 Gelatin

+

+

枸橼酸盐 Citrate

-

-

靛基质 Indole

+

+

尿素 Carbamide

+

nd

MR试验 MR test

-

-

VP试验 VP test

-

-

表1 菌株的生理生化试验结果。其中：+,阳性；-，阴性；nd，无参考数据。

【病原菌的形态鉴定】

E3菌株在BHI培养基28℃下长势良好，经24h培养可形成淡黄色菌落或者半透明状白色菌落。菌落呈短杆状，表面光滑，末端稍带锥形。革兰氏染色镜检为G-，具有荚膜, 无芽孢和鞭毛。E3菌株革兰氏染色形态见图1。

1

图1

【病原菌的PCR检测】

1.病原菌DNA模板的制备：取50μL buffer和2μL E3菌液于EP管中，充分混匀后放入T100™ Thermal Cycler进行16S热变性15分钟后得到DNA模板。

2.病原菌的16SrDNA PCR扩增：选用华大基因公司合成的16SrDNA通用引物，加入2.5μL mix、15μL ddH2O、2μL 16SrDNA F、2μL 16SrDNA R、6μL 模板DNA混合成50μLPCR反应体系，反应条件为94℃,10min+{(94℃,0.5min) +(55℃,0.5min) +(72℃,1.5min)}×30  +72℃,5min。

3.琼脂糖凝胶电泳：取10μL扩增产物在1%琼脂糖凝胶点样孔内点样，并用加入3μL 2000bp的D2000 DNA Marker作为标准，待电泳完成后使用JY04S-3C凝胶成像系统观察电泳结果（图2）。

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图2  

4. 16SrDNA基因测序

电泳后阳性的PCR产物送华大基因测序，测序结果（图3）在NCBI网站进行BLAST同源性比对后发现，E3菌株的16SrDNA基因序列与脑膜炎败血伊丽莎白菌的同源性高达98%，置信度高达99%。结合E3菌株的形态鉴定、生化鉴定，可确定E3致病菌为脑膜炎败血伊丽莎白菌(Elizabethkingia meningoseptica)。

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图3

 

【病原菌的回归试验】

根据科赫法则，回归动物，将E3菌液注射同等太小的健康黑斑蛙体内，观察7日。攻毒蛙出现歪脖（图4），在水中打转，白内障（图5）等与临床一致的症状，死亡蛙剖检见肝脏肿大（图6）、脾脏出血（图7）。并对死亡蛙及时剖检和病原菌再次分离与鉴定。

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图4

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图5

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图6

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图7

 【药敏试验】

    病原菌E3对29种药敏试剂的敏感程度见表2。由表中可看出在15种药物中，达到极高敏感程度的药物有派唑西林、氯霉素、头孢哌酮、多西环素等6种药物，达到高敏感程度的有克林霉素、氧氟沙星、头孢曲松，其他的万古霉素、朱诺环素、四环素等20种药物只有中低敏感程度。其中万古霉素被农业部列为禁用于所有食品动物的兽药，不能用于实际生产当中。

表2药敏试验结果

名称

抑菌圈直径（单位mm）

敏感度

名称

抑菌圈直径（单位mm）

敏感度

派唑西林

28

极敏

环丙沙星

9

低敏

氯霉素

27

极敏

头孢氨苄

8

低敏

头孢哌酮

27

极敏

头孢拉定

7

低敏

多西环素

25

极敏

诺氟沙星

7

低敏

麦迪霉素

21

极敏

苯唑西林

7

低敏

红霉素

20

极敏

呋喃唑酮

7

低敏

克林霉素

16

高敏

青霉素

7

低敏

氧氟沙星

15

高敏

庆大霉素

7

低敏

头孢曲松

15

高敏

头孢他啶

7

低敏

万古霉素

14

中敏

多粘菌素B

7

低敏

朱诺环素

14

中敏

新霉素

7

低敏

丁胺卡那

12

中敏

卡那霉素

7

低敏

四环素

12

中敏

氨苄西林

7

低敏

羧苄西林

11

中敏

头孢呋平

6

低敏

复方新诺明

10

中敏

 

 

 

 

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大鲵皮病

然而随着我国大鲵饲养规模及集约化程度的不断发展，大鲵的病害问题日趋严重, 已经严重制约了大鲵养殖业的健康发展。尤其是大鲵的“腐皮、烂肢病”最为突出，病原以摩氏摩根菌、韦氏气单胞菌等为主，各大鲵养殖场均有发生，发病率一般在10-17%左右，发病后死亡率55%以上，该病一旦发生，常规药物治疗效果较差，多数以死亡告终，给养殖户造成巨大的经济损失。

禽腺病毒I群血清4型（FAdV-4）

鸡安卡拉病，是由禽腺病毒I群4型感染引起的一种鸡传染病，也叫心包积液—肝炎症，鸡感染发病后死亡率最高80%以上。病毒在鸡体内潜伏期短、发病迅速，通常仅见精神沉郁，排黄色稀粪等，从发病到死亡高峰期出现仅需12-36h，病鸡会突然倒地，在数分钟后死亡。 目前，已完成病毒分离鉴定、培养方法（SPF鸡胚和细胞），禽腺病毒I群4型卵黄抗体的实验室研究，结果显示该卵黄抗体可有效预防鸡安卡拉病。

鹅星状病毒（“鹅痛风病”）

2014年，致腹泻型的鹅源星状病毒在国内首次被报道；2016年以来，致痛风型鹅星状病毒在国内鹅养殖区爆发流行。 在重庆市技术创新与应用示范专项重点示范项目资金资助下，围绕鹅星状病毒的分离鉴定、培养、检测方法建立和卵黄抗体研发开展一系列研究，发现鹅星状病毒有抗体依赖性增强作用，发表中文核心期刊论文3篇、SCI论文1篇，获得新兽药临床试验批件1个。 目前，正在开展鹅星状病毒抗体依赖性增强作用的机理研究和鹅星状病毒基因工程亚单位疫苗研发。

鸭圆环病毒（鸭“脱毛、矮小综合征”）

圆环病毒感染导致水禽羽毛脱落、发育不良和屠宰后酮体毛根残留，引起免疫抑制和导致继发细菌、病毒的感染或二重及多重混合感染，严重危害我国鸭、鹅和番鸭养殖业。圆环病毒目前无可靠的培养方法，实验室攻毒用强毒主要采自病禽的法氏囊，本团队围绕鸭圆环病毒衣壳蛋白的基因工程表达和疫苗、卵黄抗体研发开展一系列研究。 目前，已完成鸭圆环病毒基因工程表达载体（pET-32a（+）-sDuCap）构建，蛋白的高效表达、纯化工艺研究，鸭圆环病毒衣壳蛋白的免疫保护试验和鸭圆环病毒卵黄抗体的实验室研究，结果显示鸭圆环病毒衣壳蛋白免疫原性良好，可作为疫苗和卵黄抗体制备用抗原。