青蛙脑膜炎败血伊丽莎白菌研究成果

【实验动物】

病蛙样本采自开州区某黑斑蛙养殖基地，体重、体况相近的健康黑斑蛙采购于重庆本地市场。

【实验试剂】

脑心浸液肉汤（BHI）购于北京华越洋生物科技有限公司，16SrDNA引物合成于华大基因，药敏试纸购于杭州微生物试剂有限公司，微量生化管购于杭州微生物试剂有限公司，多西环素购自重庆某公司，水溶性氟苯尼考购于江苏某公司，细菌基因组DNA提取试剂盒、DNA-marker DL-2000、Lysis Buffer为上海生工产品，其他涉及到的NaCl、酵母提取物、蛋白胨、琼脂糖均为国产分析纯试剂。

【实验仪器】

T100™ Thermal Cycler，美国BIO-RAD公司；凝胶成像系统JY04S-3C，北京君意东方电泳设备有限公司；制冰机IMS-20，常熟市雪科电器有限公司；生化培养箱LRH-250F，上海齐欣科学仪器有限公司；电泳仪JY200C，北京君意东方电泳设备有限公司；洁净工作台SW-CJ标准型，苏州安泰空气技术有限公司；LX-600微型离心机，其林贝尔仪器制造有限公司；海尔冰箱BCD-192KTJX，青岛海尔股份有限公司；立式压力蒸汽灭菌器YXQ-50A，上海博迅医疗生物仪器股份有限公司；电子分析天平EL104，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；Cascada BIO实验室超纯水系统，美国PALL公司。

【病原菌的分离】

在超净工作台内用酒精棉球对病蛙的体表进行初步消毒，准备好手术刀，剪刀等器械并提前用酒精灭菌，点燃酒精灯，在酒精灯旁切开病蛙的脑部，用镊子夹出病蛙脑组织，放入装有灭菌生理盐水的2ml规格的灭菌EP管内，并放于冰箱-20℃低温保存。

【病原菌的纯化】

提前用BHI配制好固体培养基和液体培养基（固体培养基中还需额外加入琼脂），取分离的脑组织在平板上进行多次划线并置于28℃恒温培养箱培养18-24小时，用接种环挑取单菌落接种于液体培养基中，放置在摇床上培养24小时后得到单菌落菌液。

【病原菌的生化鉴定】

将分离纯化后的单菌落（E3）菌液充分摇匀后，用接种环接种于葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、硫化氢、果糖等15个微量生化管中，放置于38℃恒温培养箱培养18-24小时后观察实验结果（表1）。可见E3菌株与脑膜炎败血伊丽莎白菌生理生化特性基本上一致,与相关资料中该菌种的特征相吻合，根据其生理生化特征的鉴定结果，可初步判断菌株E3为脑膜炎败血伊丽莎白菌。

表1生化鉴定结果

表1 菌株的生理生化试验结果。其中：+,阳性；-，阴性；nd，无参考数据。

【病原菌的形态鉴定】

E3菌株在BHI培养基28℃下长势良好，经24h培养可形成淡黄色菌落或者半透明状白色菌落。菌落呈短杆状，表面光滑，末端稍带锥形。革兰氏染色镜检为G-，具有荚膜, 无芽孢和鞭毛。E3菌株革兰氏染色形态见图1。

图1

【病原菌的PCR检测】

1.病原菌DNA模板的制备：取50μL buffer和2μL E3菌液于EP管中，充分混匀后放入T100™ Thermal Cycler进行16S热变性15分钟后得到DNA模板。

2.病原菌的16SrDNA PCR扩增：选用华大基因公司合成的16SrDNA通用引物，加入2.5μL mix、15μL ddH2O、2μL 16SrDNA F、2μL 16SrDNA R、6μL 模板DNA混合成50μLPCR反应体系，反应条件为94℃,10min+{(94℃,0.5min) +(55℃,0.5min) +(72℃,1.5min)}×30  +72℃,5min。

3.琼脂糖凝胶电泳：取10μL扩增产物在1%琼脂糖凝胶点样孔内点样，并用加入3μL 2000bp的D2000 DNA Marker作为标准，待电泳完成后使用JY04S-3C凝胶成像系统观察电泳结果（图2）。

图2  

4. 16SrDNA基因测序

电泳后阳性的PCR产物送华大基因测序，测序结果（图3）在NCBI网站进行BLAST同源性比对后发现，E3菌株的16SrDNA基因序列与脑膜炎败血伊丽莎白菌的同源性高达98%，置信度高达99%。结合E3菌株的形态鉴定、生化鉴定，可确定E3致病菌为脑膜炎败血伊丽莎白菌(Elizabethkingia meningoseptica)。

图3

【病原菌的回归试验】

根据科赫法则，回归动物，将E3菌液注射同等太小的健康黑斑蛙体内，观察7日。攻毒蛙出现歪脖（图4），在水中打转，白内障（图5）等与临床一致的症状，死亡蛙剖检见肝脏肿大（图6）、脾脏出血（图7）。并对死亡蛙及时剖检和病原菌再次分离与鉴定。

图4

图5

图6

图7

 【药敏试验】

    病原菌E3对29种药敏试剂的敏感程度见表2。由表中可看出在15种药物中，达到极高敏感程度的药物有派唑西林、氯霉素、头孢哌酮、多西环素等6种药物，达到高敏感程度的有克林霉素、氧氟沙星、头孢曲松，其他的万古霉素、朱诺环素、四环素等20种药物只有中低敏感程度。其中万古霉素被农业部列为禁用于所有食品动物的兽药，不能用于实际生产当中。

表2药敏试验结果